现代电子显微镜技术在病毒检测中的应用进展(2)
超薄切片染色作为电镜生物样品制备的最后一步,染色好坏直接影响到电镜照片的质量。文献报道,超薄切片过程中对样本采用插入式滴染法、连续染色方式、微波辅助染色等技术能够有效提高染色效率,减少染色污染,进而在电镜下显示清晰的超微结构[7]。
3.3 免疫凝集反应
1941 年,病毒学家通过烟草花叶病毒首次观察到抗体-病毒凝集反应[8]。Almeida 和Waterson 用电镜观察到病毒颗粒凝集现象[9],免疫电镜应运而生,它可以有效提高病毒检测的灵敏度。液相免疫电镜检测观察病毒时利用病毒和抗体反应的特异性找到病毒,但如果抗体过量可能导致病毒表面被包裹,不利于病毒的观察。而对于固相免疫电镜,抗体首先需粘附在铜网上后再和病毒颗粒发生作用,使病毒颗粒固定在铜网上进行负染色。免疫电镜可被用于观察那些研究较为表浅、不能在体外细胞培养条件下进行孵育的病毒,常常采用抗血清直接处理病毒感染标本,筛选出病毒进行免疫电镜观察。而对于那些新发未知病毒,其抗原抗体特性未知,则可采用广谱的丙种球蛋白来筛选病毒进行免疫电镜观察。
3.4 免疫共定位
电镜技术结合免疫金、免疫金银标记法对病毒进行观察,可以发现不同的病毒蛋白在细胞中的定位特点,比如通过超薄切片技术结合免疫金银染色发现了HIV 的反义蛋白及其与宿主细胞膜的定位关系[10]。
免疫电镜技术已成为分子细胞生物学研究的重要手段。该技术利用超薄切片和免疫标记能够准确的定位蛋白质和脂类[11]。
3.5 冷冻电镜及断层成像技术
快速将病毒悬浮液冷冻后成为玻璃状样品,可以保证病毒结构的原始性。样品通常被迅速放置于液氮中进行处理,然后转移至电镜的低温样品室进行观察,再通过数字成像技术多角度对样品进行图片采集,经过计算机三维重构得到病毒完整三维形态图片。另外,通过这一技术还可观察到抗病毒药物作用于病毒后,病毒形态结构发生改变的特征[3]。
冷冻电子显微学和电子断层成像依然是一个年轻的学科,处于发展和完善阶段,要采用更好的样品制备方法(如高压冷冻、冷冻替代、冷冻切片等),改进数据收集方法、硬件及软件,发展更好的电子断层成像数据处理、分析和理解方法,结合电子断层成像和单颗粒分析技术获得更多的结构细节,发展新的电子断层成像技术,才能更好地促进冷冻电子断层成像技术在病毒检测领域的应用[12]。
4 生物安全技术
用电镜观察那些可感染人类的病毒时要相当小心,样品处理过程最好在生物二级实验室进行研究,包括铜网负染色步骤,并且将铜网拿出实验室放置电镜进行观察之前,要保证铜网上的病毒已无感染性。
综上所述,电镜技术在不断的发展过程中充分与免疫学、细胞化学等技术相融合,可直接观察到生物细胞内的病毒粒子及大分子,对于新发和未知病原体的研究起着重要的诊断作用。本文仅阐述了基于电子显微镜研究病毒涉及到的相关技术,随着电子显微技术的发展以及制样方法的不断改进和完善,这将极大的发挥电子显微镜技术的优势并克服其局限性,电子显微镜技术也会在病毒诊断领域中发挥更大的作用。
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文章来源:《锻压技术》 网址: http://www.dyjszzs.cn/qikandaodu/2021/0722/641.html
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